耐多藥肺結核診斷主要取決于對細菌耐藥性的分析。耐多藥患者通常氣道內能夠找到結核菌，結核菌找到后需要進行細菌培養和藥敏分析，這屬于一個是傳統分析過程。藥敏分析后可以看到結核菌對于哪些藥物存在耐藥，常見有利福平耐藥、異煙肼耐藥等。 現在有較快速的方法，即進行耐藥基因檢測，特別是利福平，目前已經發現耐藥基因，通過耐藥基因快速檢測可以較早知道是否存在利福平耐藥，往往利福平耐藥患者較大部分對異煙肼也存在耐藥。 診斷耐藥性肺結核需要通過細菌學依據，通過藥敏或分子診斷依據確定，到底是屬于耐藥結核還是普通結核。這是診斷耐藥結核的唯一辦法，也是金標準，一般無法通過其它辦法，如影像學都無法診斷，一定是需要通過藥敏培養和分子學診斷。