目前新生兒膽道閉鎖的確診屬于世界性難題，無特異性檢查可以確診膽道閉鎖，比較多見的是實驗室檢查。膽道閉鎖通常表現為中度或者高度的直接膽紅素升高，占總膽紅素水平的50%-80%；轉氨酶正常或輕度增高，γ谷氨酸肽酶明顯增高，血清膽紅素水平持續不變或進行性升高。特別是當直接膽紅素占總膽紅素60%以上，是診斷膽道閉塞最重要的實驗室檢查。 較多用的還有影像學檢查，膽總管閉鎖伴囊性擴張具有診斷意義，同時可以幫助排除先天性膽管擴張癥和其它膽道畸形，放射性核素掃描可以區分肝細胞功能障礙和膽道梗阻。CT、ERCT、MRCT與超聲相比，在膽道閉鎖的診斷方面并不具有優勢。 目前國際上對嬰幼兒應用CT的放射暴露已經逐漸得到重視，建議不要輕易進行CT檢查，開腹和腹腔鏡技術實施膽道造影檢查是確診的唯一方法，造影可以清晰顯示肝內外膽道情況。膽囊穿刺為白膽汁，膽囊置管注入濃度30%左右的碘海醇注射液或者泛影葡胺，膽總管遠端通暢而近端未顯影，需壓迫膽管再次造影，若無肝內膽管顯影則診斷為膽道閉鎖。肝門部有囊腫可直接穿刺囊腫造影，膽囊比較塌陷無法置管時可診斷為膽道閉鎖。其他檢查包括經皮肝穿刺、十二指腸引流液分析等，但臨床應用比較少。